1925年初，蒋先云毕业留校，担任校长蒋介石的秘书。2月，“小蒋”随“老蒋”参加第一次东征，两次负伤;6月在广州平定“杨刘”叛乱中，只身带领一个连冲进市中心，占领了滇军总指挥部，立下奇功;8月又参加第二次东征，已担任第1军3师7团党代表的他在三次负伤的情况下，亲率敢死队一举攻占了“历史上从未被攻克过”的惠州城。蒋先云虽深得蒋介石的钟爱和青睐，并被迅速提拔，但他却信仰笃定、刚正不阿，1926年“中山舰事件”发生后，蒋介石以“中将教育长”的职务诱使他脱离共产党，具有双重党员身份的蒋先云，却第一个公开声明脱离了国民党。1926年7月北伐战争开始后，蒋先云任北伐军总司令部机要秘书，“北伐文告，多出其手”，旋任补充第五团团长，授陆军少将军衔，转战粤、湘、赣、鄂。蒋介石数次派人力邀蒋先云，许以第1军第1师师长之职，前提是“必须发表退出共产党的声明”。蒋先云不为所动，拂袖而去。
1926年底蒋先云毅然离开蒋介石前往武汉，担任湖北全省总工会工人纠察队总队长。“四一二”政变发生后，武汉各界成立“反蒋委员会”，公推蒋先云为主席，在武昌阅马场举行声势浩大的三十万余人“讨蒋大会”，通过《反蒋宣传大纲》、《告(黄埔军校)各期全体同学书》等文告，出版《讨蒋特刊》，高呼：“昔日校长，今日校贼!”“蒋贼不除，世无天日!”蒋先云发表了慷慨激昂的讨蒋演说，表明与蒋介石彻底决裂的坚定立场。1927年4月，25岁的蒋先云满怀一腔热血和革命情怀，投入到第二次北伐，并被任命为第11军26师77团团长兼党代表。5月28日率部在河南临颍与奉系军伐作战时，身先士卒，不幸中弹，壮烈牺牲!
1927年6月8日，在武昌中央军事政治学校操场，中共中央为蒋先云烈士举行追悼大会。武汉国民政府要员，国民革命军高级将领以及各界人士6万余人参加追悼会，周恩来主持追悼会并发表沉痛讲话，恽代英致悼词，罗章龙宣读悼亡诗：“东南北战斗犹艰，战士升腾武胜关。千古悲风临颖路，中原忍见将星残”……中共中央刊物《向导》198期发表《悼蒋先云同志》一文;国民革命政府追赠其为中将军衔。1984年，蒋先云在黄埔军校时的同期同学——中国人民解放军元帅徐向前在其回忆录里，称“蒋先云是我的良师益友，他斗争坚决，作战勇敢，头脑敏捷，堪为青年军人的模范”，评价不可谓不高。
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